Par Leonardo Calcagno

Présenté par bioMérieux

ALTÉRANTS DE LA BIÈRE : QUELS SONT LES PRINCIPAUX MICRO‑ORGANISMES D’ALTÉRATION À CONSIDÉRER ?

Du point de vue de la sécurité du consommateur, la bière a historiquement toujours été considérée comme une boisson sûre (comparativement à l’eau), dans la mesure où aucun agent pathogène n’y a été détecté. Cela s’explique en partie parce que le moût est porté à ébullition dans la cuve de brassage, mais également en raison du taux d’alcool, des résines de houblon et d’un pH bas. Cela étant dit, certains contaminants microbiens, appelés « beer spoilers » (micro‑organismes responsables de l’altération de la bière), peuvent se développer dans la bière et être à l’origine de faux‑goûts, d’acidité, d’arômes indésirables ainsi que de bières troubles.

Du point de vue de la fermentation, ils peuvent également interférer et entrer en compétition pour les nutriments essentiels avec la souche de levure de brasserie introduite, entraînant une fermentation dite « bloquée » ou une « sur‑atténuation ».

Deux grands groupes de micro‑organismes sont responsables de la contamination du moût et de la bière :
– les bactéries
– les levures sauvages

Ci‑dessous figure une vue d’ensemble des agents d’altération décrits dans la littérature (Bokulich, 2013). Les micro‑organismes responsables de l’altération de la bière les plus fréquemment rencontrés sont mis en évidence, les bactéries lactiques étant rapportées comme responsables de 60 à 90 % des contaminations.

Bokulich, N.A. and Bamforth, C.W. (2013). The Microbiology of Malting and Brewing. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 77, 157-172

ALTÉRATION BACTÉRIENNE

Bien que le moût de bière puisse être considéré comme un milieu microbiologique favorable, la bière elle‑même doit être considérée comme une boisson microbiologiquement stable grâce à la présence d’éthanol (0,5–10 %), de composés amers du houblon, notamment les iso‑alpha‑acides (généralement présents à des concentrations de 17 à 55 ppm), d’un niveau élevé de CO₂ (0,5 % m/v), d’une teneur extrêmement faible en oxygène (< 0,1 ppm) rendant la bière quasi anaérobie, d’un pH très bas (souvent compris entre 3,7 et 4,8), sans oublier l’appauvrissement du profil nutritionnel après fermentation par la levure de brasserie.

D’un point de vue de classification, les bactéries Gram positif sont les plus fréquemment rencontrées, bien que certaines bactéries Gram négatives puissent occasionnellement être responsables de l’altération de la bière.

Bactéries Gram positif

Les bactéries Gram positif (dont la paroi cellulaire retient le colorant violet du test de Gram, leur donnant une apparence bleutée au microscope) ne survivent généralement pas dans la bière (y compris les pathogènes potentiels). Toutefois, certaines espèces appartenant aux genres Lactobacillus et Pediococcus, communément appelées bactéries lactiques (LAB), peuvent survivre et constituent de loin les agents d’altération de la bière les plus fréquemment rencontrés.

Bactéries lactiques – amies ou ennemies ?

Amies : comme leur nom l’indique, elles produisent de l’acide lactique, un acide plus doux et au goût plus net que l’acide acétique. Les bières de blé allemandes acidulées, telles que la Berliner Weisse et la Gose, sont acidifiées à l’aide de ces bactéries, qui sont également présentes dans les fermentations lambic.

Ennemies : considérées comme responsables de 60 à 90 % des contaminations, elles constituent de loin le problème microbiologique le plus courant (Back, 2003). Les espèces responsables de l’altération de la bière présentent une forte résistance aux iso‑alpha‑acides du houblon, liée à la présence des gènes de résistance horA et horC (Suzuki et al., 2005).

Pourquoi est‑il important de déterminer si les LAB possèdent les gènes de résistance au houblon ?

La capacité à différencier les bactéries lactiques possédant les gènes horA et horC de celles qui en sont dépourvues est essentielle pour le brasseur et le responsable du contrôle qualité, car elle permet d’estimer le niveau de risque de détérioration du produit final. Les bactéries contenant ces gènes constituent une menace réelle pour la qualité, tandis que celles qui en sont dépourvues sont davantage des indicateurs de l’efficacité des opérations de nettoyage et de désinfection. Actuellement, cette distinction n’est possible, en pratique, que par des tests PCR (Polymerase Chain Reaction) réalisés dans les laboratoires de brasserie.

Est‑il facile de cultiver des LAB responsables de l’altération de la bière sur une boîte de Pétri ?

La facilité et la rapidité de croissance des LAB sur les milieux de détection utilisés en contrôle qualité se révèlent souvent variables, en particulier lors de l’isolement primaire des souches responsables de l’altération de la bière, ce qui peut conduire à des échecs de détection par les tests de QC (Suzuki, 2012). L’une des principales raisons est l’adaptation de ces organismes à l’environnement de brasserie, rendant les milieux de culture peu adaptés (profil nutritionnel, pH, etc.).

LACTOBACILLUS

Bactéries Gram positif, anaérobies facultatives ou micro‑aérophiles, en forme de bâtonnets, non sporulées. Parmi plus de 100 espèces de lactobacilles, seules 13 à 14 sont reconnues comme responsables de l’altération de la bière. L’espèce la plus fréquemment rencontrée est Lactobacillus brevis, hétéro‑fermentaire (capable de produire soit de l’alcool, soit de l’acide lactique à partir des sucres), avec une croissance optimale à 30 °C et à un pH compris entre 4 et 6. Lactobacillus lindneri est la deuxième espèce la plus fréquemment rencontrée ; elle est hautement résistante aux composés du houblon (Back, 1981), présente une croissance optimale entre 19 et 23 °C (Priest, 1987) et résiste à des traitements thermiques plus élevés que les autres bactéries lactiques.

Liste des lactobacilles responsables de l’altération de la bière : Lactobacillus brevis, lindneri, buchneri, parabuchneri, casei, coryneformis, malefermentans, curvatus…

Les lactobacilles sont souvent difficiles à cultiver sur de nombreux milieux de détection décrits dans l’industrie brassicole et peuvent provoquer des incidents d’altération sans être détectés par le contrôle qualité microbiologique. Soumises à des stress (alcool, pH bas, résines de houblon…), ces bactéries peuvent entrer dans un état dormant dit « viables mais non cultivables » (VBNC).

PEDIOCOCCUS

Bactéries cocciques Gram positif, anaérobies facultatives, présentant un métabolisme homo‑fermentaire (conversion du glucose en acide lactique). Toutefois, les produits finaux du métabolisme varient selon les conditions ; les Pediococcus responsables de l’altération de la bière produisent typiquement du diacétyle comme sous‑produit majeur.

Liste des Pediococcus responsables de l’altération de la bière : Pediococcus damnosus, acidilactici, pentosaceus, parvulus, inopinatus, halophilus, dextrinicus et urinaeequi.

P. damnosus se développe à des températures relativement basses, avec un optimum compris entre 22 et 25 °C. En raison de cette capacité de croissance à basse température, l’altération peut survenir lors des phases de fermentation et de maturation, ainsi que dans les produits conditionnés. La contamination par Pediococcus pose également problème au niveau des levures d’ensemencement, car ces bactéries peuvent se fixer aux cellules de levure et sont difficiles à éliminer.

BACTÉRIES GRAM NÉGATIF

Seules quelques bactéries Gram négatives sont responsables de l’altération de la bière. Elles sont divisées en deux catégories :
1) Les plus fréquemment rencontrées : les anaérobies strictes des genres Pectinatus, Megasphaera et Zymophilus
2) Les bactéries Gram négatives aérobies et anaérobies facultatives telles que les bactéries acétiques, Zymomonas et certaines entérobactéries

Anaérobies strictes

Pectinatus et Megasphaera : ces bactéries anaérobies Gram négatives sont beaucoup moins fréquemment rencontrées comme agents d’altération que les bactéries lactiques. Cependant, contrairement aux bactéries lactiques, lorsqu’elles sont présentes, elles sont considérées comme des altérants obligatoires (Sakamoto et Konings, 2003), c’est‑à‑dire que si elles sont identifiées, il y a une contamination à traiter. Elles peuvent trouver des niches favorables en brasserie et survivre pendant des années sans défauts évidents (Hakalehto, 2000). Puis, à la faveur de défauts technologiques ou d’un nettoyage insuffisant, elles peuvent contaminer et altérer la bière.

Pectinatus

Les Pectinatus sont des bâtonnets mobiles droits à légèrement courbés, observés en général sous forme de cellules isolées ou par paires. Le nom du genre provient du latin « pecten » = peigne, car leur forme caractéristique évoque un peigne : les flagelles (au nombre de 1 à 23) sont situées d’un seul côté de la cellule. Ils se développent entre 15 et 40 °C, avec un optimum à 28–32 °C. Au‑delà de 50 °C, ils meurent.

Megasphaera

Les Megasphaera ont une forme de cocci légèrement ovales et sont observés seuls ou par paires. Cinq espèces sont distinguées dans le genre Megasphaera, dont Megasphaera cerevisiae, Megasphaera paucivorans et Megasphaera sueciensis, uniquement associées à des bières altérées.

Selenomonas

Le genre Selenomonas comprend actuellement 10 espèces, dont une seule, Selenomonas lacticifex, a été isolée en association avec une levure de brasserie contaminée (Schleifer et al., 1990) et plus récemment à partir d’un biofilm à la surface d’un équipement dans l’atelier d’embouteillage (Vávrová et al., 2014).

Zymophilus

Deux espèces, Zymophilus paucivorans et Zymophilus raffinosivorans, sont toujours rencontrées en opérations brassicoles — dans la levure d’ensemencement et dans les déchets de production de bière. Zymophilus tire son nom de son site de présence le plus courant — la levure — du grec « zyme » = levure et « philos » = ami (Schleifer et al., 1990). Les bactéries du genre Zymophilus sont des bâtonnets mobiles, droits, légèrement courbés à hélicoïdaux, observés le plus souvent isolés ou par paires, plus rarement en courtes chaînes.

BACTÉRIES ACÉTIQUES

Les bactéries acétiques oxydent typiquement l’éthanol pour produire de l’acide acétique (vinaigre) et sont donc utilisées pour la production commerciale de vinaigre. Cette famille de bactéries Gram négatives (Acetobacteriaceae) comprend une dizaine de genres, dont les plus courants sont Acetobacter, Gluconobacter et Gluconacetobacter.

Les bactéries acétiques sont largement distribuées ; on les retrouve notamment sur les plantes et les fruits, ainsi que dans l’air. Elles peuvent provoquer une altération sévère de la bière si elles y ont accès en présence d’oxygène. Comme elles tolèrent l’acidité et l’éthanol et ne sont pas inhibées par les composés du houblon, elles se développent rapidement dans la bière, entraînant des faux‑goûts acides et de la turbidité. Toutefois, tant que la bière est correctement stockée et que le niveau d’oxygène est faible, elles ne posent pas de problème. C’est pourquoi elles causent le plus souvent des problèmes dans les bières de fût conditionnées pendant le service.

Acetobacter

Parmi les espèces validées de bactéries acétiques (AAB), dix espèces d’Acetobacter ont été associées aux environnements brassicoles ; Acetobacter aceti, Acetobacter liqueficiens, Acetobacter pastorianus et Acetobacter hansii sont fréquemment retrouvées en brasserie.

Gluconobacter

Une seule espèce de Gluconobacter (Gluconobacter oxydans) a été rapportée comme régulièrement associée aux environnements de brasserie. Toutefois, Gluconobacter cerevisiae a également été signalée.

Zymomonas

Bâtonnets courts et trapus observés isolés, par paires, parfois en chaînes ou en rosettes. Ces bactéries sont Gram négatif, non sporulées, catalase positives. Les Zymomonas sont aéro‑tolérantes et anaérobies facultatives. Elles tolèrent l’éthanol (en dessous de 10 % v/v) et se développent de façon optimale à un pH supérieur à 3,4 et à une température de 25 à 30 °C.

ENTEROBACTERIACEAE

Il s’agit d’une grande famille de bactéries Gram négatif anaérobies facultatives. Plusieurs espèces appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, telles que Klebsiella, Citrobacter, Obesumbacterium et Hafnia, sont rapportées comme associées à l’altération du moût non fermenté et du moût en fermentation. Elles sont capables d’utiliser la lactose avec formation de gaz et d’acides à 35–37 °C en 48 heures. Ces bactéries ne se développent normalement pas dans la bière finie, mais peuvent être observées aux étapes initiales du procédé de brassage, provoquant de faux‑goûts indésirables persistants dans le produit final. Les bactéries coliformes sont des indicateurs des conditions d’hygiène et du niveau de sanitation en brasserie.

Obesumbacterium spp.

Cette bactérie a été identifiée dans la levure d’ensemencement et le moût en fermentation ; toutefois, elle n’a jamais été observée dans la bière en raison de son incapacité à se développer en dessous de pH 3,9. O. proteus est rencontrée aux premiers stades de la fermentation où elle entre en compétition avec la levure pour les nutriments, entraînant une fermentation plus lente. Obesumbacterium proteus produit également des métabolites tels que le diméthyl‑sulfoxyde (DMS), responsable d’un arôme de type panais, ainsi que de l’acétoïne, de l’acide lactique, du propanol, de l’isobutanol et du 2,3‑butanediol.

Autres coliformes pouvant être trouvés en brasserie

Observés occasionnellement, ils servent d’indicateurs d’hygiène et ne se développent normalement pas dans la bière finie. Ils peuvent être rencontrés aux premiers stades du procédé de brassage, provoquant de faux‑goûts indésirables qui persistent et peuvent se retrouver dans le produit final.

Des coliformes tels que Citrobacter freundii, Rahnella aquatilis, Klebsiella oxytoca et Klebsiella terrigena ont été observés à la fois dans le moût non fermenté et dans le moût en fermentation. Néanmoins, ces bactéries sont inhibées par l’alcool et ne surviennent que durant les premières étapes de la fermentation, étant rarement retrouvées dans la bière.

Citrobacter freundii

Citrobacter freundii est une anaérobie facultative, morphologiquement mobile, bâtonnet fin et court observé isolé ou par paires, et catalase positive. Cette bactérie est inhibée par l’alcool et n’apparaît qu’aux premiers stades de la fermentation, rarement dans la bière. Sa présence est rapportée comme augmentant le taux de fermentation et la production de diacétyle, d’acide lactique, d’acétaldéhyde et de diméthyl‑sulfure (DMS).

Klebsiella terrigena et K. oxytoca

Klebsiella terrigena et K. oxytoca ont été identifiées en brasserie. Les espèces Klebsiella sont importantes car elles produisent des faux‑goûts phénoliques issus de la décarboxylation de l’acide férulique présent dans le moût, de manière similaire à certaines levures sauvages.

Rahnella aquatilis

Rahnella aquatilis (anciennement Enterbacter agglomer) a été isolée de diverses sources telles que le sol, l’eau, les aliments, des végétaux et occasionnellement des prélèvements cliniques. En environnement brassicole, elle a été rapportée comme contaminant de levures de fermentation haute et de moûts fermentés.

LEVURES SAUVAGES

Une levure sauvage est, par définition, une levure qui n’a pas été délibérément utilisée et qui n’est pas sous contrôle total ; elle provient souvent de l’environnement. À l’exception des lambics et d’autres bières à fermentation spontanée, les levures sauvages sont considérées comme des organismes d’altération en brasserie et sont évitées autant que possible. Il convient toutefois de souligner que toutes les levures sauvages n’endommagent pas nécessairement une bière ; leur présence indique néanmoins une infection et un problème de sanitation en brasserie.

Lorsqu’on parle de « levures sauvages », on distingue généralement les « levures Saccharomyces » et les « levures non‑Saccharomyces ».

Levures non‑Saccharomyces

Brettanomyces/Dekkera : le genre Brettanomyces a été isolé pour la première fois en Grande‑Bretagne (1904) [du grec Brettano (brasseur britannique) et Myces (champignon)]. Brettanomyces est la variante asexuée (non sporulée), tandis que Dekkera est la forme téléomorphe (sexuée). Cinq espèces de Brettanomyces sont actuellement décrites.

Brettanomyces (« Brett ») est capable de résister à des taux élevés d’alcool et peut se développer dans des environnements pauvres en oxygène ainsi qu’à pH bas, ce qui lui permet de prospérer dans des environnements de fermentation alcoolique. Il peut aussi fermenter des sucres en conditions aérobies (effet Crabtree) et dispose d’une stratégie supplémentaire de compétition via la production d’acide acétique en conditions aérobies. Brett peut également supplanter S. cerevisiae dans certaines conditions de fermentation. Il peut métaboliser un large éventail de sources de carbone (maltose, fructose, glucose), et même des sucres complexes peu utilisés par S. cerevisiae tels que la cellobiose et les dextrines, entraînant des bières « super‑atténuées » avec un degré d’alcool plus élevé et des concentrations en sucres plus faibles.

D’autres levures non‑Saccharomyces peuvent se développer dans la bière et sont occasionnellement observées (par ex. Pichia spp., Candida spp., Torulaspora delbrueckii et Zygosaccharomyces…).

En général, leur potentiel d’altération est limité dans des conditions optimales en raison de l’accès limité à l’oxygène, de la toxicité de l’éthanol et de la compétition pour les nutriments avec Saccharomyces. On peut retrouver la plupart de ces levures dans toute la brasserie, notamment dans des robinets/ports d’échantillonnage encrassés et d’autres surfaces en contact avec la bière. Elles produisent des faux‑goûts (en particulier des acides organiques et des POF), du trouble, des sédiments ou des films de surface. Elles doivent être considérées comme des contaminants opportunistes, causant des altérations lorsque les conditions leur sont favorables, mais ne posent généralement pas de problème dans les pratiques modernes de brassage. Elles sont davantage problématiques dans les bières élevées en barrique, où l’entrée d’oxygène stimule leur croissance, d’où la nécessité de limiter l’espace de tête lors de la maturation en barrique.

Levures Saccharomyces sauvages

Une contamination croisée par une souche de S. cerevisiae autre que celle prévue peut provoquer des défauts de saveur ainsi que des performances de fermentation inhabituelles. La levure sauvage Saccharomyces la plus problématique et la plus discutée est Saccharomyces diastaticus, apparue depuis quelques années comme altérant et retrouvée dans le monde entier dans l’industrie brassicole.

Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, comme son nom l’indique, est une variante de S. cerevisiae qui possède le gène STA (1, 2 ou 3). Ces gènes conduisent la levure à produire une enzyme, la glucoamylase, capable d’hydrolyser des glucides plus complexes, notamment les dextrines, en sucres simples, entraînant une hyper‑atténuation. Il en résulte généralement :

– Hyper‑atténuation (> 90 %) et/ou fermentation secondaire
– Sur‑carbonatation (observée comme un « gushing » au moment de l’ouverture de la bouteille/canette/fût)
– Faux‑goûts

Sources possibles de diastaticus :
• Mauvaise hygiène :
  – À l’atelier d’embouteillage/de mise en canettes (> 70 % des cas rapportés) [Meier‑Dörnberg, 2017]
  – Salle de brassage
  – Cuves de fermentation
  – Zone de stockage
• Matières premières :
  – Levure
  – Houblon (par ex. houblonnage à cru / dry hopping)

NB : certaines levures diastaticus peuvent être utilisées pour produire des bières complexes et intéressantes — les bières de type « Saison » en sont un exemple parfait. La manipulation de ces levures en brasserie nécessite de la rigueur et un plan de contrôle qualité bien pensé afin d’éviter les contaminations croisées.

POINTS CLÉS

• Les bactéries lactiques [LAB] (lactobacilles et pédiocoques) sont responsables de 60 à 90 % des problèmes d’altération de la bière.
  • Il existe plus de 100 espèces de lactobacilles, mais seules environ 14 sont reconnues aujourd’hui comme « altérantes de la bière ».
  • Les LAB sont difficiles et lentes (2 à 4 jours) à cultiver sur les milieux de QC en raison de leur adaptation profonde à l’environnement de la bière, ce qui augmente le risque de faux négatifs.
  • La présence des gènes de résistance au houblon horA et horC dans les LAB est perçue comme un indicateur fiable pour la gestion du risque, et ne peut être détectée que par des méthodes PCR.
  • Les bactéries anaérobies (Megasphaera spp. et Pectinatus spp.) ne sont généralement rencontrées que dans des bières < 5 % d’alcool et dans des conditions de très faible oxygène. Toutefois, lorsqu’elles sont présentes, elles sont considérées comme des altérants obligatoires.
  • Saccharomyces var. diastaticus est le plus souvent responsable du « gushing » en raison d’une fermentation secondaire indésirable. La source de la contamination peut provenir principalement de la levure ou de l’environnement de la brasserie une fois installée.
  • Les « levures sauvages » (c.-à-d. Brettanomyces/Dekkera) sont problématiques parce qu’elles résistent à des taux élevés d’alcool, se développent dans des environnements pauvres en oxygène et à pH bas, ce qui leur permet de prospérer dans la bière.

References:
Back W. 1981. Bierschadliche Bakterien – Taxonomie der bierschaldlichen Bakterien. Monatsschrift fur Brauerie, 34
Back W. 2003. Bioflime in der Brauerie und Getrankeindustrie – Brauwelt Online 23/25 1-5
Hill A.E 2015. Brewing Microbiology – 1st Edition 
Meier-Dörnberg, T., Jacob, F., Michel, M., & Hutzler, M. (2017). Incidence of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus in the Beverage Industry: Cases of Contamination , 2008 – 2017, 54(4), 140–148.
Priest F.G. 1987. Brewing Microbiology. Elsevier Applied Science
Suzuki K et al 2005. Isolation of hop-sensitive variant from Lactobacillus lindneri and identification of genetic marker for beer spoilage ability of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 71, 5089-5097
Suzuki K. 2012. 125th Anniversary review. Microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. Journal of the institute of brewing, 117

————–

• Entreprise familiale, bioMérieux est devenue un leader mondial dans le domaine du diagnostic in vitro. Depuis plus de 100 ans, l’entreprise poursuit une mission claire : améliorer la santé publique à travers le monde.
• Assurer la sécurité et la qualité des aliments, boissons et produits pharmaceutiques du quotidien est essentiel. C’est pourquoi bioMérieux propose l’une des gammes les plus complètes de solutions manuelles et automatisées pour le contrôle microbiologique industriel. Ces outils permettent de vérifier la qualité des matières premières, de contrôler les procédés et l’environnement de production, ainsi que d’analyser les produits finis.
• Dans l’industrie des boissons, maintenir la qualité à chaque étape de la chaîne d’approvisionnement exige des diagnostics rapides et précis afin d’identifier, surveiller, contrôler et prévenir les risques de contamination et d’altération. En tant que partenaire de confiance, bioMérieux développe des solutions innovantes qui améliorent la gestion des risques, préviennent les incidents et soutiennent la performance opérationnelle.

Pour plus d’information :
Luttez contre les levures et les bactéries altérantes pour garantir la performance et la profitabilité de votre brasserie.